MECANISMO DE LA INACTIVACION DE PEROXIDASAS VEGETALES POR HIDROPEROXIDOS. IMPLICACION EN PROCESOS FISIOLOGICOS Y BIOTECNOLOGICOS.

Autor: HERNANDEZ RUIZ JOSEFA
Año: 1998
Universidad: MURCIA
Centro de realización:
Centro de lectura: BIOLOGIA
Director: ACOSTA ECHEVERRIA MANUEL
Tribunal: GARCIA CANOVAS FRANCISCO , VARON CASTELLANOS RAMON , SANCHEZ BRAVO JOSE , CASAS MARTINEZ JOSE LUIS , RODRIGUEZ LOPEZ JOSE NEPTUNO
Resumen de la tesis

Las peroxidasas son hemoenzimas ampliamente distribuídas en los diferentes reinos. Se encuentran localizadas en: animales, plantas, hongos y organismos procariotas. Las peroxidasas de plantas se caracterizan por ser glicoproteínas monoméricas que contienen dos iones calcio y 4 puentes disulfuro. A nivel celular se encuentran localizadas en apoplasto y vacuolas. Como enzima más representativa y estudiada se encuentra la peroxidasa de raíz de rábano conocida por sus siglas en inglés como HRP. Se trata de una enzima de secreción, que interviene en diversos procesos: formación de radicales libres (síntesis de pared celular); oxidación de metabolitos secundarios (reacción de defensa); regulación del crecimiento y diferenciación celular. Las peroxidasas tienen un gran interés medio ambiental y biotecnológico. Son utilizadas para el tratamiento de residuos industriales y agrarios; en las industrias papeleras para el blanqueamiento de la pulpa de celulosa; en la obtención de plantas transgénicas; en el control de plagas mediante la síntesis de insecticidas no perjudiciales para el medio ambiente. Además son utilizadas a nivel industrial: como biosensores y biocatalizadores para la fabricación de productos de interés tecnológico; como marcadores térmicos; para la medida de actividad antioxidante. En clínica e investigación para la realización de inmunoensayos y estudios de citoquímica. Estas importantes aplicaciones hacen necesario un mejor conocimiento del mecanismo de actuación de HRP, así como el estudio de su inactivación por distintos sustratos, en especial por el peróxido de hidrógeno (H202). El objetivo es mejorar la sensibilidad y la eficiencia de las diversas aplicaciones diseñadas para esta enzima. En esta memoria se propone un mecanismo de reacción global de HRP en presencia de H202 y ausencia de reductores. En estas condiciones el H202 se comporta a la vez como sustrato oxidante y como sustrato reductor. Este mecanismo consta de tres rutas: dos catalíticas y una de inactivación. Según este modelo el H202 actuaría como un inactivador suicida ya que es sustrato de la enzima y a la vez la conduce hacia la inactivación. Los resultados que se presentan sirven para caracterizar y confirmar el mecanismo de reacción global de HRP demostrándose, mediante la determinación de una serie de parámetros cinéticos, la existencia de una inactivación suicida. Así, la reacción de HRP con hidroperóxidos en ausencia de sustratos reductores resulta ser irreversible y dependiente del tiempo, además de presentar saturación y protección por el sustrato. Por otra parte, se estudia de una forma exhaustiva cada una de las dos rutas catalíticas, demostrándose que HRP presenta actividad catalasa con H202 y que ésta actúa como vía de protección de la enzima ante la inactivación. También se ha utilizado como sustrato alternativo al H202 un hidroperóxido xenobiótico: el ácido m-cloroperoxibenzoico, con el que se estudia la reacción en dos estados: pseudo-estacionario y preestacionario. Este estudio permite, mediante el uso de técnicas de espectrofotometría clásica y de flujo detenido (stopped-flow), detectar por primera vez intermedios claves para la actividad de esta enzima y calcular los valores de las constantes catalíticas y de inactivación que caracterizan el sistema de reacción. También se propone un mecanismo de reacción simplificado que permite hacer análisis cinéticos más sencillos. Este modelo ha sido aplicado para la realización de estudios de tipo: -Comparativo, con nueve isoenzimas (ácidas y básicas) de HRP procedentes de distintas casas comerciales. Se les ha determinado, además de sus constantes catalíticas y de inactivación, su grado de pureza, punto isoeléctrico y peso molecular. Ambos tipos de isoenzimas se comportan de forma distinta catalíticamente y en su capacidad de inactivación. Los resultados obtenidos deben tenerse en cuenta a la hora de seleccionar la isoenzima de HRP más adecuada para una aplicación biotecnológica concreta. -Estructural, sobre distintas variantes de la enzima obtenidas por mutagénesis dirigida. Los mutantes utilizados permiten determinar qué función desempeñan en la actividad catalítica los aminoácidos sustituídos. -Fisiológico, sobre una peroxidasa localizada en el apoplasto de hipocótilos de Lupinus albus L., estudiándose su inactivación "in vivo" (dentro del tejido vegetal) por la aplicación de un estrés oxidativo y su inactivación "in vitro" por peróxido de hidrógeno. Los resultados obtenidos indican que esta enzima de secrección denominada LuP-B2 al igual que HRP sufre inactivación suicida, dependiente del tiempo y de la concentración del sustrato inactivador. La semejanza entre ambas enzimas indica que el proceso de inactivación puede desempeñar un papel fisiológico relevante en el desarrollo vegetal y en situaciones de estrés.
Materias relacionadas