L'INHIBIDOR DE CARBOXIPEPTIDASA DE PATATA PCI COM A MOLÉCULA MODEL PER A NOUS MÉTODES D'ENGINYERIA DE PROTEÏNES I PROTEÓMICA. DESENVOLUPAMENT DE NOVES APLICACIONS DE L¡ESPECTROMETRIA DE MASSES MALDI-TOF.

Autor: VILLANUEVA CARDUS JOSE
Año: 2000
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA
Centro de lectura: CIENCIAS
Director: QUEROL MURILLO ENRIQUE
Tribunal: PARES XAVIER , PLANES ANTONI , PRAT SALOME , BACARDIT JORDI , FARRES JAUME
Resumen de la tesis

La primera parte de la tesis consiste en dos trabajos de ingeniería de proteínas utilizando como proteína modelo el inhibidor de carboxipeptidasa de patata (PCI). En el primero de los trabajos se ha llevado a cabo el clonaje y la caracterización del cDNA que codifica para el PCI. En primer lugar se determinó cual es la secuencia de DAN de la región codificante para el gen del PCI. Además se ha estudiado al inducción de la expresión génica de este gen en la planta de patata, determinando también su localización subcelular.También se ha sugerido una posible función del pro-péptido carboxiterminal como una señal de direccionamiento vacuolar. Por otra parte se han realizado estudios funcionales y estructurales preliminares del PCI con el propéptido N-terminal. En el segundo trabajo se ha construído una nueva variante del PCI, el retroCI, en el que se han mantenido los espacios entre cisteinas pero no la secuenica entre ellas (el denomiando efecto contexto) para estudiar si el espacio entre cisteína pero no la secuencia entre ellas (el denominado efecto contexto) para estudiar si el espacio entre cisteínas es capaz de gobernar la formación específica de los puentes disulfuro. Además la variante construída tiene la particularidad de ser una retroproteína, es decir, una proteína en que la dirección del esqueleto proteico se ha invertido. Se ha construído, expresado, purificado y caracterizado. En la segunda parte de la tesis se han desarrollado dos nuevas técnicas de espectrometría de masas para péptidos y proteínas. La primera de estas técnicas es una aplicación de la espectrometría de masas MALDI-TOF a la monitorización de la expresión y la pruficación de proteínas recombinates. Esta técnica esta basada en uan resina de fase reversa para desalar y concentrar protéinas antes de ser analizadas por espectrometría de masas. Esta técnica ha sido de gran utilidad a la hora de analizar, por espectrometría de masa, muestras que contenián altas concentraciones de sales, caotropos o detergentes, o muestras que venían de cultivos bacterianos que expresaban proteínas recombianntes. La segunda aplicación es el desarrollo de una metodología para monitorizar el intercambio H/D en proteínas enteras. En este trabajo se ha deteminado el núcleo de intercambio lento del PCI en diferentes estados de plegamientos y se han comparado,mediante este parámetro, el dominio de activación de la procarboxipeptidasa A2 humana (ADA2h) silvestre versus tres mutantes con diferente estabildiad conformacional.
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