ESTRUCTURA, DINAMICA Y CARACTERIZACION ELECTROSTATICA DE LA PROTEINA ALFA-SARCINA POR RESONANCIA MAGNETICA NUCLEAR.

Autor: PEREZ CAÑADILLAS JOSE MANUEL
Año: 1999
Universidad: AUTONOMA DE MADRID
Centro de realización:
Centro de lectura: CIENCIAS
Director: BRUIX BAYES MARTA
Tribunal: SIEIRO DEL NIDO CARLOS , SANTORO SAID JORGE , GARCIA MATEO MAURICIO , SANCHEZ RUIZ JOSE MANUEL , MARTINEZ DEL POZO ALVARO
Resumen de la tesis

La alfa-Sarcina es una proteína extracelular producida por el hongo Aspergillus giganteus. Su principal característica reside en su elevada citotoxicidad, derivada de su capacidad para inactivar de forma irreversible los ribosomas de todos los organismos estudiados hasta la fecha. Esta tesis trata de la aplicación de la técnica de resonancia magnética nuclear para la obtención de información estructural, dinámica y electrostática de la alfa-Sarcina, a un nivel de resolución atómico. En primer lugar se ha obtenido la estructura 3D en disolución de la alfa-Sarcina por RMN con un elevado nivel de resolución. Las estructura obtenida es de gran calidad ya que está de acuerdo con toda la información experimental. El elevado grado de precisión de la estructura ha permitido identificar las interacciones que definen el plegamiento de la enzima (enlaces de hidrógeno, puentes salinos, núcleos hidrófobos... etc), algunas de las cuales podrían ser importantes para la estabilidad termodinámica de la proteína. La estructura de la alfa-Sarcina se ha comparado con otras de ribonucleasas relacionadas, lo que ha permitido la identificación de los residuos que forman parte del centro activo del enzima. En un segundo apartado se ha caracterizado la dinámica de la proteína mediante la medida de parámetros de relajación de 15N a dos campos magnéticos (600 MHz y 750 MHz). El ajuste conjunto de toda la información ha permitido caracterizar la dinámica de rotación de la molécula. La alfa-Sarcina se comporta como un rotor anisotrópico con simetría axial con un tiempo de correlación de 7.7 ns. El análisis de la dinámica interna está en general de acuerdo con la precisión de la estructura obtenida. Diversas regiones muestran procesos dinámicos lentos respecto al movimiento de rotación de la molécula. Estas regiones podrían estar involucras en procesos de apertura cierre de la estructura y/o en interacción con el sustrato natural. En un tercer apartado se han caracterizado algunas propiedades electrostáticas de la alfa-Sarcina. Se han medido los valores de pKa, para los residuos Asp, Glu e His, en la proteína libre y en un complejo con el nucleótido 2'GMP. Los valores obtenidos permiten identificar residuos que participan en interacciones potencialmente importantes para la estabilidad del estado plegado. La comparación de los valores de pKa para los residuos del centro activo, con los de residuos estructuralmente equivalentes de la RNasa T1, ha permitido establecer las bases estructurales de la diferencia de actividad entre ambas enzimas. De forma paralela se ha realizado un análisis de la actividad enzimática con el pH en la reacción de hidrólisis del dinucleótido ApA, que ha permitido proponer un mecanismo ribonucleolítico y asignar los diferentes papeles de los residuos catalíticos en el mismo gracias al conocimiento de sus valores de pKa. Finalmentetoda la información obtenida se ha utilizado para esclarecer las bases estructurales de la elevada especificidad de la alfa-Sarcina. Para ello se ha construido un modelo de interacción con un análogo de sustrato, que permite identificar las regiones responsables del reconocimiento selectivo.
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