En el presente trabajo se ha abordado el desarrollo de
vectores no virales para terapia génica en músculo. Las formas farmacéuticas escogidas a tal efecto han sido del tipo micropartículas biodegradables, fabricadas a partir de copolímeros de ácido láctico-co-glicólico. En dichas micropartículas se han
encapsulado tanto DNA plasmídico (pDNA) como adenovirus recombinantes defectivos. Se buscó caracterizar y evaluar las micropartículas formuladas, así como diseñar un método de fabricación que garantizase la integridad del material génico
encapsulado.
Las micropartículas se prepararon mediante el método de la evaporación del disolvente tras la formación de una emulsión múltiple de tipo A/O/A. Para ello se empleó un nuevo procedimiento patenado llamado TROMS ("Total Recirculation One-Machine
System"). En dicho procedimiento, la emulsificación de las fases se consigue mediante la inyección turbulenta de las mismas. Se analizaron los factores con influencia en la formación de la emulsión múltiple, el tamaño de las micropartículas
obtenidas y la encapsulación de una molécula hidrosoluble modelo (fluoresceína sódica). En concreto, se estudió la influencia del tiempo de recirculación de las emulsiones en el sistema, el diámetro interno de las agujas empleadas y el flujo de
bombeo de las fases. Una vez estudiado el procedimiento, se procedió a su aplicación para encapsular pDNA (cuyo gen marcador fue el de la luciferasa bajo el promotor del citomegalovirus (CMV), denomidano abreviadamente px2luc) y adenovirus (cuyo gen
marcador fue el de la beta-Galactosidasa, también bajo el promotor del CMV, denominado AdvLacZ). Así mismo se comparó con procedimientos convencionales de fabricación, en concreto el uso de ultrasonidos para la primera emulsión (A/O) y del
Ultra-Turrax para la segunda (emulsión A/O/A). Las micropartículas preparadas se caracterizaron en cuanto a su tamaño, morfología, integridad del material encapsulado, contenido en principio activo y eficacia de encapsulación. Así mismo se evaluó su
eficacia para liberar de forma sostenida el principio activo encapsulado (ensayos de liberación in vitro) y su eficacia tras su administración in vivo tras su inyección en músculo.
El TROMS resultó ser un procedimiento de fabricación adecuado y versátil para formular micropartículas, en el que se puede escoger de forma sencilla el tamaño de las mismas como su formulación, hasta el punto de resultar útil para su aplicación
a escla semi-industrial. La formación de la emulsión se produce bajo condiciones más suaves energéticamente que las técnicas convencionales de homogeneización, tal y como se concluyó analizando la integridad del material encapsulado (tanto px2luc
como AdvLacZ). Las micropartículas con pDNA liberación de forma sostenida el plásmido durante 24 ó 40 días, dependiendo del polímero empleado en la fabricación. La integridad del plásmido liberado se conservó en gran medida a lo largo del ensayo. Su
aplicación in vivo, comparada con la administración de DNA desnudo, mostró eficacias de transfección no muy altas a corto plazo, pero de larga duración y constantes en el tiempo. En cuanto a las micropartículas con adenovirus, se consiguió la
liberación de partículas infectivas in vitro durante al menos 5 días. In vivo mostraron eficacias de transducción incluso 7 semanas después de la administración.