AVANCES SOBRE EL TRANSPORTE DE CALCIO EN EL RETICULO SARCOPLASMICO: CARACTERIZACION DE DOMINIOS ESTRUCTURALES Y FUNCIONALES DE LA CALCIO-ATPASA.

Autor: VELASCO GUILLEN ISABEL
Año: 1999
Universidad: MURCIA
Centro de realización:
Centro de lectura: QUIMICA
Director: GOMEZ FERNANDEZ JUAN CARMELO
Tribunal: GARCIA DE LA TORRE JOSE , GUTIERREZ MERINO CARLOS , RUBIO ZAMORA VICENTE , ILLUNDAIN LARRAÑETA M. ANUNCIACION ANA , SOLER PARDO FERNANDO
Resumen de la tesis

Al tratarse de una proteína de membrana la Ca2+-ATPasa es una proteína difícil de estudiar. En el trabajo realizado en esta Tesis Doctoral se ha profundizado en el conocimiento de diferentes aspectos estructurales y funcionales de la proteína que son importantes para llegar a conocer el mecanismo molecular de la misma. Utilizando para ello diferentes técnicas. Uno de los estudios se ha centrado en la localización de los centros de unión de calcio de la proteína utilizando para ello la sonda fluorescente NCD-4, ya que esta se une fuertemente al centro de unión de calcio de alta afinidad en la proteína. Mediante estudios de atenuación de fluorescencia se ha localizado esta sonda a 16,5 A desde el centro de la bicapa lipídica. También se ha realizado la localización de la misma en la proporción transmembranal de la proteína, concretamente en el segmento Leu253-Glu309, señalando este residuo de glutámico como posible diana para el NCD-4. Todos estos resultados nos indican que el dominio de unión de calcio se encuentra localizado próximo a la superficie de la membrana pero en un entorno hidrofóbico. Otro de los estudios llevados a cabo ha sido la caracterización cinética de la modificación de la proteína por fenilmaleimida, que es un compuesto que reacciona con residuos de cisteína de las proteínas. La unión de este compuesto a la proteína la inhibe fuertemente, siguiendo una cinética de pseudo-primer orden, inhibiendo la transferencia de fosfato del ATP a la enzima para formar un intermedio fosforilado, indicando que la unión debe producirse en un residuo de cisteína próximo al sitio de fosforilación por lo que la Cys377 y la Cys349 podrían ser buenos candidatos para reaccionar con fenilmaleimida. Caracterización cinética de la modificación de la ATPasa por el ácido maleimidilsalicílico, así como localización del aminoácido marcado por ese compuesto en la Ca2+-ATPasa. La unión de este compuesto a la proteína la inhibe fuertemente siguiendo una cinética de inhibición de pseudo-primer orden, inhibiendo la unión de nucleótidos a la proteína. La ocupación del sitio de unión de nucleótidos da lugar a la protección de la proteína de la inhibición. Mediante el análisis de la secuencia de aminoácidos y la espectroscopía de masas nos indican que el sitio de unión de la sonda a la proteína es la Cys344. Se han realizado medidas de transferencia de energía de fluorescencia estimando que la distancia entre el ácido maleimidilsalicílico y los residuos de triptófano de la proteína, y desde el ácido maleimidilsalicílico a la superficie de la membrana es de 21 A.
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